Baza Wiedzy

Lactobacillus plantarum

Lactobacillus plantarum jest zaliczany do bakterii kwasu mlekowego, która pełni istotną funkcję przemysłową (Parente E., Ciocia F., Ricciardi A., Zotta T., Felis G. E., Torriani S. 2010. Diversity of stress tolerance in Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus and Lactobacillus paraplantarum: a multivariate screening study. International Journal of Food Microbiology 144, 270-279). Bakterie te powszechnie występują w żywności fermentowanej, oliwkach, serach, winie
i kiszonkach (Tanganurat W., Quinquis B., Leelawatcharamas V., Bolotin A., 2009. Genotypic and phenotypic characterization of Lactobacillus plantarum strains isolated from Thai fermented fruits and vegetables, Journal Basic Microbiology 49, 377–385). W związku z tym szczepy z tego gatunku posiadające właściwości probiotyczne mają swoje zastosowanie przy produkcji żywności funkcjonalnej, terapeutycznej oraz jako potencjalne doustne, żywe szczepionki (Shah N.P., 2007. Functional cultures and health benefits. International Dairy Journal 17, 1262–1277).

Mechanizm działania bakterii probiotycznych jest wieloczynnikowy i swoisty dla poszczególnych szczepów (Tuohy K.M., Probert H.M., Smejkal C.W., Gibson G.R., 2003. Using probiotics and prebiotics to improve gut health. Drug Discovery 8, 692–700). Jednym z lepiej poznanych sposobów działania probiotyków wobec patogenów jest antagonizm oparty na wydzielaniu przez probiotyki do środowiska substancji bakteriostatycznych i/lub bakteriobójczych opisany przez Kesarcodi-Watson i wsp., (Kesarcodi-Watson A., Kaspar H., Lategan M.J., Gibson L., 2008. Probiotics
in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening processes. Aquaculture, 274, 1–14). Uważa się, że obecność probiotyków w jelicie lub na powierzchni, skórze, gospodarza hamuje rozwój bakterii potencjalnie chorobotwórczych (Verschuere L., Heang H., Criel G., Dafnis S., Sorgeloos P., Verstraete W., 2000. Protection of Artemia against the pathogenic effects of Vibrio proteolyticus CW8T2 by selected bacterial strains. Applied and Environmental Microbiology, 66, 1139–1146). To przeciwbakteryjne działanie wywołują poszczególne lub w połączeniu ze sobą substancje wytwarzane przez bakterie takie jak: antybiotyki, bakteriocyny, lizozym, proteazy, nadtlenek wodoru, amoniak, diacetyl, siderofory, kwasy organiczne pojedyncze (Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P., Verstraete W., 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology and Molecular Biology Review, 64, 655–671). Efektywność antagonizmu opartego na wydzielaniu do środowiska inhibitorów jest w dużej części zależna od warunków
w jakich prowadzone jest doświadczenie. Biedrzycka i wsp. (Biedrzycka E., Markiewicz L.H, Bielecka M., Siwicki A.K., 2007. Kształtowanie mikroekosystemu przewodu pokarmowego, Sterowanie rozwojem układu pokarmowego
u nowonarodzonych ssaków, pod red. Zabielskiego R., Wydawnictwo Rolne i Leśne, 5, 126-140) wykazali, że antagonistyczna aktywność szczepów probiotycznych to nie tylko wytwarzanie inhibitorów, ale również uniemożliwienie kolonizacji poprzez koagregację komórek bakterii probiotycznych z komórkami patogenów i rywalizacja
o miejsce przyłączenia do błon śluzowych gospodarza. W proces ten zaangażowane są różne mechanizmy np.: interakcje elektrostatyczne, oddziaływania hydrofobowe, kwasy lipotejchojowe (Gómez R., Geovanny D., Balcázar J.L., Shen M, 2007. Probiotics as control agents in aquaculture, Journal of Ocean University of China, 6, 76-79 ). Właściwości te umożliwiają i pomagają bakteriom w utrzymaniu znacznej przewagi
w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt, ale dynamiczna i bardzo złożona reakcja mikroorganizmów jest niezwykle ważna dla komórek nabłonka jelit i układu odpornościowego gospodarza (Shi HN, Walker A. Bacterial colonization and the development of intestinal defenses, 2004, Can. J Gastroenterol, 18, 493-500). Umożliwia zachowanie homeostazy i inicjuje odpowiednie reakcje organizmu przeciw patogenom.

Wykazano, że stosowane preparaty probiotyczne wywierają korzystny wpływ na skórę poprzez ich działanie na oś „jelito-mózg-skóra”. Według tego założenia, niewłaściwa dieta uboga w błonnik pokarmowy, stres, terapie antybiotykowe powodują nadmierny rozwój w jelitach mikroorganizmów potencjalnie patogennych i/lub patogennych. Efektem tego jest osłabienie bariery jelitowej i wchłanianie do krwiobiegu substancji toksycznych wywołujących proces zapalny. Co u osób predysponowanych do trądziku pospolitego, trądziku różowanego i alergii może prowadzić do zaostrzenia zmian skórnych. Dlatego za zasadne uznaje się zastosowanie bakterii probiotycznych o potwierdzonych właściwościach, w kremach lub maściach jako tzw. swoistej „tarczy” chroniącej przed patogenami. Działanie to opiera się na hamowaniu kolonizacji patogenów występujących na skórze przez blokowanie ich adherencji przy jednoczesnej produkcji substancji działających antybakteryjnie. Ponadto bakterie probiotyczne hamują odpowiedź immunologiczną i w efekcie zmniejszają stan zapalny w skórze. Dodatkowo rozkładają sebum i inne wydzieliny skóry sprawiając tym samym łatwiejsze przyswajanie składników odżywczych zawartych w kremie.

Szczep Lactobacillus plantarum AMT14 pochodzi ze środowiska roślinnego. Szczep został zdeponowany zgodnie zgodnie z traktatem Budapesztańskim w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapi Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk. Depozyt złożono w dniu 11-09-2015 r. i nadano numer B/00092.

 

            W celu określenia zdolności antybakteryjnych bakterii L. plantarum AMT14 wobec wybranych patogenów należących do gatunków Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis, Escherichia coli i Staphylococcus aureus poprowadzono wspólne hodowle w mleku hydrolizowanym zapewniającym dobry wzrost szczepowi hamującemu- Lactobacillus plantarum AMT14 i hamowanym- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis KOS64, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis 65/s/10, Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli Nissle1917, Staphylococcus aureus ATCC33862.

 

W przeprowadzonych badaniach in vitro stwierdzono całkowitą redukcję liczby bakterii Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis KOS64, Escherichia coli Nissle1917 i Staphylococcus aureus ATCC33862 w czasie 24 godzinnej inkubacji,
a szczepów Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis 65/s/10
i Escherichia coli O157:H7 po 48 godzinnej wspólnej hodowli z Lactobacillus plantarum AMT14. Nie odnotowano znaczącego wpływu negatywnego bądź pozytywnego samego podłoża na wyniki aktywności antybakteryjnej Lactobacillus plantarum AMT14 wobec wybranych patogenów należących do gatunków Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis, Escherichia coli i Staphylococcus aureus.

Wyniki podano w tabeli nr 1, przedstawionej poniżej.

 

Tabela nr 1. Badanie in vitro antaginistycznych działania szczepu Lactobacillus plantarum AMT14 wobec  czynników patogennych przewodu pokarmowego i skóry

*Nb – nieobecne w 1 ml hodwli

Badany szczep Lactobacillus plantarum AMT14 wykazał 100% przeżywalność
w niskim pH =3 oraz 89% przeżywalność w obecności soli żółci.

Wyniki wykazały dużą oporność szczepu Lactobacillus plantarum AMT14 na niskie pH jak i na sole żółci co świadczy o przystosowaniu tego szczepu do warunków panujących w przewodzie pokarmowym.

Bifidobacterium

Rodzaj Bifidobacterium (łac. ”bifidus” – rozdwojony) – po raz pierwszy wyizolowane i opisane w latach 1899-1900 przez Tissiera – to Gram-dodatnie pałeczki o nieregularnej morfologii (Krieg N.R., Holt J. G., Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Wiliams and Wilkins, 1984, Vol. 2). Osiągają rozmiary w przedziale 0,5–1,3×1,5–8μm. Mogą być proste lub rozdwojone. Różnią się kształtem w zależności od gatunku i szczepu oraz warunków środowiska w jakim żyją. Komórki bakterii świeżo izolowanych z przewodu pokarmowego lub podłoży namnażających, w optymalnych warunkach inkubacji wykazują zwykle charakterystyczne  formy X, Y lub V, ale także maczugowate lub łopatkowate, z reguły o zaokrąglonych końcach. Występują pojedynczo lub w skupiskach, nie poruszają się i nie tworzą form przetrwalnych.

Bifidobakterie wymagają ściśle beztlenowych warunków wzrostu (Müller G., Podstawy Mikrobiologii żywności WNT, 1990, Warszawa). Namnażają się w temperaturze 37-41⁰C, w środowisku o pH w przedziale 6,0–7,0. Wytwarzają podstawowe metabolity- kwas mlekowy i octowy. Wykazują aktywność wewnątrzkomórkowego enzymu fosfoketolazy-fruktozo-6-fosforanu (FKF6F). Enzym ten uczestniczy w metabolizmie glukozy w specyficznym szlaku przemian enzymatycznych – tzw. „szlaku bifidowym”. Jest to enzym charakterystyczny dla rodzaju Bifidobacterium – na jego podstawie można je identyfikować do rodzaju.

Naturalnym środowiskiem występowania bifidobakterii są tak zwane krypty: 0,7-milimrtrowe, gęsto upakowane zagłębienia w nabłonku błony śluzowej jelita grubego (Saloff- Coste C.J., Bifidobacteria. Danone World Newsletter, 1997, 16, 1-9; Schlegel H.G., Mikrobiologia ogólna, 2000, PWN, Warszawa). Komórki bakterii adherują do mikrokosmków na powierzchni enterocytów nie powodując ich uszkodzenia i do pokrywającego komórki nabłonkowe śluzu.

Bifidobakterie pełnią wiele korzystnych funkcji, jak (Hoover D.G., Bifidobacteria: activity and potential benefits, Food Technol., 1993, 47, 120-124; Gibson G.R., Wang X, Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria, J. Appl. Bacteriol., 1994, 77, 412-420; Gomes A.M. P., Malcata F. X., Bifidobacterium ssp. and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics, 1999, Trends in Food Science and Technology, 10, 139-157):

– udział w procesach trawienia i metabolizmu

– synteza witamin: B1, B2, B6, B12, kwasu nikotynowego i foliowego

– ochrona przewodu pokarmowego przed kolonizacją patogenów

– hamowanie wzrostu bakterii gnilnych i chorobotwórczych.

Rozwój i ostateczna stabilizacji mikroekosystemu przewodu pokarmowego kształtuje się w wyniku równowagi pomiędzy mikroflorą przewodu pokarmowego, fizjologicznym oddziaływaniem organizmu, dietą oraz czynnikami zewnetrznymi (Biedrzycka E., Markiewicz L.H, Bielecka M., Siwicki A.K., 2007, Kształtowanie mikroekosystemu przewodu pokarmowego, Sterowanie rozwojem układu pokarmowego u nowonarodzonych ssaków, pod red. Zabielskiego R., Wydawnictwo Rolne i Leśne, 5, 126-140). Produkowane przez te bakterie kwasy octowy i mlekowy obniżają pH treści jelita grubego, hamując wzrost bakterii patogennych takich jak: Escherichia coli, Shigella, Clostridium perfringens. Z uwagi na bardzo ważną rolę jaką pełnią bifidobakterie w prawidłowym kształtowniu się w początkowym etapie mikroekosystemu przewodu przewodu pokarmowego oraz na fakt, że w późniejszym okresie życia liczebność populacji bifidobakterii ulega poważnej redukcji, co skutkuje przyśpieszeniem procesów starzenia, pogorszeniem zdrowia i samopoczucia. Za zasadne uważa się suplementację diety ludzi bakteriami należącymi do szczepu Bifidobacterium animalis AMT30 o potwierdzonych właściwościach bójczych wobec patogennych bakterii i grzybów.

Szczep Bifidobacterium animalis AMT30 został wyizolowany ze stolca dorosłego człowieka. Szczep został zdeponowany zgodnie zgodnie z traktatem Budapesztańskim w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapi Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk, 53-114 Wrocław, ul. Rudolfa Weigla 12. Depozyt złozono w dniu 31-05-2016 r. Depozytowi nadano numer B/00109

Badanie antagonistycznych właściwości szczepu Bifodobacterium animalis AMT30 wobec patogenów: Escherichia coli O157:H7 (szczep enterokrwotoczny), Candida albicans 637, Candida krusei 8.

W przeprowadzonych badaniach in vitro stwierdzono całkowitą redukcję liczby bakterii enterokrwotocznego szczepu Escherichia coli O157:H7 oraz grzybów Candida albicans 637 i Candida krusei 8 w czasie 72 godzinnej inkubacji hodowli wspólnej z Bifidobacterium animalis AMT30. Wyniki podano w tabeli nr 2, przedstawionej poniżej.

Tabela nr 2.   Hamowanie wzrostu patogennych bakterii i grzybów przez Bifidobacterium animalis AMT 30

Nb*- nieobecne w 1 ml hodowli wspólnej z Bifidobacterium animalis AMT30

Przeżywalność szczepu Bifidobacterium animalis AMT30 w niskim pH oznaczono przez obniżenie kwasowości hodowli Bifidobacterium animalis AMT30 będącej
w stacjonarnej fazie wzrostu do wartości pH równej 3. Natomiast w przypadku oznaczenia przeżywalności szczepu Bifidobacterium animalis AMT30 w obecności soli kwasów żółciowych, na początku podwyższono wartości pH hodowli Bifidobacterium animalis AMT30 do wartości równej 6, a następnie dodano sole żółciowe w ilości stanowiącej 3% hodowli.

Tabela nr 3 Przeżywalność szczepu Bifidobacterium animalis AMT30 w pH=3

Tabela nr 4 Przeżywalność szczepu Bifidobacterium animalis AMT30 w obecności 3% soli kwasów żółciowych

Badany szczep Bifidobacterium animalis AMT30 przeżywalność
w niskim pH =3 oraz 94% przeżywalność w obecności soli żółci o stezeniu.

Wyniki wykazały dużą oporność szczepu Bifidobacterium animalis AMT30 na niskie pH jak i na sole żółci co świadczy o przystosowaniu tego szczepu do warunków panujących w przewodzie pokarmowym.

Bifidobacterium animalis AMT30 wykazuje unikalne szerokie spektrum antybiotykooporności wobec antybiotyków. W obecności niektórych: kolistyna, toltrazuryl, amprolium, chlorowodorek lewamizolu, flubendazol, neomecyna, sulfachloropirazyna sodowa stwierdzono znakomitą zdolność namnażania się szczepu AMT30 w odniesieniu do liczebności jaką szczep osiągnął w hodowli kontrolnej. Natomiast w obecności Trimetoprim/sulfmetoksazolu, Tylmykozyny i tylozyny liczebność Bifidobacterium animalis AMT30 utrzymała się na poziomie inokulum. W przypadku hodowli wspólnych z Tiamuliną, Enrofloksacyną, Florfenikolem, Amoksycykliną,  Doksycykliną, Amoksycykliąna + kwas klawulanowym, Fenoksymetylopenicyliną, Linkomycyną i Tylwalozyną odnotowano spadek liczby bakterii szczepu AMT30 od 1 do 3 rzędów wielkości w porównaniu do kontroli.

 

BADANIE – WYNIKI

Na podstawie analizy mikrobiologicznej weryfikującej aktywność produktów przeciwko wybranym patogenom produkt

NATURE SCIENCE (MYCOBIOTIC) okazał się 5 krotnie lepszy od produktu B w aktywności przeciwko Staphylococcus aureus koag (+)podczas 24h inkubacji i 10 krotnie lepszy podczas 48h inkubacji

W przypadku aktywności wobec Enterococcus faecalis L oraz Candida albicans 676 produkt Nature Science okazał się odpowiednio:

po 24h inkubacji 1 000 000 razy lepszy i 100 razy lepszy;
po 48 h inkubacji 1000 razy lepszy i 10 000 razy lepszy.

Przy pozostałych patogenach produkt Nature Science wykazywał aktywność równoważną do produktu B.

Badany materiał	Czas inkubacji
	0 h (inokulum) CFU/mL	24 h CFU/mL		48 h CFU/mL
PRODUCT B (wieloskładnikowy)	1,9 x 109		1,4 x 109	1,3 x 109
PRODUCT A (L. rhamnosus GG)	2,2 x 108		6,2 x 108	3,8 x 108
NATURE SCIENCE PRODUCT (Lactobacillus plantarum AMT14 + Bifidobacterium animalis AMT30	1,5 x 109		5,3 x 109	2,3 x 109
Escherichia coli O157:H7	6,0 x 107		3,1 x 108	1,1 x 108
Staphylococcus aureus koag (+)	9,8 x 107		1,1 x 109	9,8 x 108
Salmonella enteritidis KOS-64	1,7 x 107		1,6 x 108	6,2 x 107
Enterococcus faecalis L	6,8 x 107		1,5 x 108	8,4 x 107
Candida albicans 676	1,7 x 107		3,0 x 107	2,0 x 107
Produkt probiotyczny + patogen
Escherichia coli O157:H7 + PRODUCT B (wieloskładnikowy)	6,0 x 107	<1,0 x 100		<1,0 x 100
Escherichia coli O157:H7 + PRODUCT A (L. rhamnosus GG)	6,0 x 107	2,30 x 105		<1,0 x 100
Escherichia coli O157:H7 + NATURE SCIENCE PRODUCT	6,0 x 107	<1,0 x 100		<1,0 x 100
Staphylococcus aureus koag. (+) + PRODUCT B (wieloskładnikowy)	9,8 x 107	5,5 x 101		<1,0 x 101
Staphylococcus aureus koag (+) + PRODUCT A (L. rhamnosus GG)	9,8 x 107	1,3 x 104		3,4 x 102
Staphylococcus aureus koag (+) + NATURE SCIENCE PRODUCT	9,8 x 107	1,0 x 101		<1,0 x 100
Salmonella enteritidis KOS – 64 + PRODUCT B wieloskładnikowy)	1,7 x 107	<1,0 x 100		<1,0 x 100
Salmonella enteritidis KOS-64 + PRODUCT A (L. rhamnosus GG)	1,7 x 107	<1,0 x 100		<1,0 x 100
Salmonella enteritidis KOS-64 + NATURE SCIENCE PRODUCT	1,7 x 107	<1,0 x 100		<1,0 x 100
Enterococcus faecalis L + PRODUCT B (wieloskładnikowy)	6,8 x 107	2,0 x 106		3,0 x 103
Enterococcus faecalis L + PRODUCT A (L. rhamnosus GG)	6,8 x 107	5,4 x 107		3,6 x 103
Enterococcus faecalis L + NATURE SCIENCE PRODUCT	6,8 x 107	<1,0 x 100		<1,0 x 100
Candida albicans 676 PRODUCT B (wieloskładnikowy)	1,7 x 107	1,6 x 105		3,8 x 104
Candida albicans 676 + PRODUCT A (L. rhamnosus GG)	1,7 x 107	1,0 x 105		4,6 x 104
Candida albicans 676 + NATURE SCIENCE PRODUCT	1,7 x 107	8,4 x 103		<1,0 x 100